Module 1 - biologie cellulaire : méthodes d'étude de la cellules

Module 1 - biologie cellulaire : méthodes d'étude de la cellules

Module 1 Biologie cellulaire Partie IV: Mthodes dtude de la cellule cours E. Grelier 1 Plan I. II. III. IV. V. Techniques de sparation et de purification cellulaire Mthodes dtude de la morphologie des cellules : techniques dexamens microscopiques Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules Mthode dtude du mtabolisme cellulaire

La culture cellulaire cours E. Grelier 2 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 1. Sparation des cellules dun tissu cours E. Grelier 3 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 1. Sparation des cellules dun tissu Tissu = ensemble cohrent de cellules Photographie au microscope optique (grossissement de 400 x) d'un tissu pithlial simple pavimenteux pritonal humain http://biology.clc.uc.edu/Fankhauser/Labs/Bio_Lab113/Tissues/Human_Histology.html

do -> ncessit dun traitement pour dissocier les liaisons intercellulaires et pouvoir tudier les cellules isoles (sauf cas du sang). cours E. Grelier 4 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 1. Sparation des cellules dun tissu 1ire tape : Destruction de la matrice extracellulaire et des jonctions intercellulaires Traitement des tissus par des enzymes protolytiques (trypsine, collagnase) Traitement des tissus par des agents chlateurs des cations divalents impliqus dans les ponts

intercellulaires (EDTA : Ethylne Diamine Ttra Actate) 2ime tape : Isolement des cellules Dissociation par une agitation mcanique douce grce une presse tissus, des aspirations et refoulements dune pipette ou dun piston (tube de Potter, homognisateur de Dounce), un vortex Filtration (sur gaze par exemple) pour obtenir une suspension cellulaire homogne

cours E. Grelier 5 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification cours E. Grelier 6 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification: adhrence et gradient Adhrence des cellules

GR et monocytes au plastique ou aux fibres de nylon : limination aprs incubation sur un support plastique pendant 1 heure 37C kratinocytes (suspension de cellules de peau) au collagne I aprs 15 min 37C. Centrifugation sur gradient de densit Sparation selon leur densit, lie au contenu cellulaire et la taille. Dpt de la suspension cellulaire sur un liquide de densit choisie en fonction des cellules sparer. Centrifugation Migration des cellules dans le liquide et localisation selon leur densit formant un anneau rcuprer par simple pipetage. cours E. Grelier 7

I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification: exemple Sparation des lymphocytes partir dune suspension de cellules splniques en gradient de Ficoll Les solutions utilises : solutions de polymres de sucres de composition variable de densits diffrentes permettant la sparation de cellules de diffrentes densits. Technique

trs simple, peu onreuse mais peu slective ne permettant pas de sparer cellules de densit proches. Dpt dun volume de sang (d = 1,006) sur un volume de Ficoll (d=1,077) Centrifugation 30 minutes 500 g 18-20 C Plasma Anneau de lymphocytes (+M et plaquettes) des cours E. Grelier Ficoll

Culot contenant polynuclaires et hmaties 8 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification: cytomtre de flux Cytomtrie de flux vido cytomtrie Cellules alignes en flux Examen individuel de chaque cellule par un rayon LASER lui affectant Tri des fractions par dviation des cellules charges au niveau de

plaques des paramtres spcifiques (Taille, Granularit,) une charge lectrique Variante : FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) utilisant Mme principe avec marquage pralable des cellules par un conjugu fluorescent (Ac coupl un fluorochrome) dtection de cette fluorescence tri selon le mme principe que prcdemment. Technique extrmement spcifique, rapide automatisable

ncessitant un appareillage sophistiqu et coteux de cytomtre/ordinateur/logiciel cours E. Grelier 9 Arrive de la suspension analyser grce une lgre surpression dans une tubulure qui assure le centrage hydrodynamique du jet Passage des cellules par un microorifice (50 70 m de diamtre) polaris permettant la mesure du volume cellulaire Interception de plusieurs faisceaux lumineux, mesure de la fluorescence mise, de la diffusion ou de la diffraction diffrents angles* laide de photomultiplicateurs Sortie du jet fractionn grce un dispositif dultrasons en gouttelettes par un deuxime microrifice (70 100 m) et charge Dviation grce un champ de haute tension selon les instructions donnes aprs traitement des donnes Acquisition et traitement des signaux provenant

des diffrents dtecteurs : affichage lcran et stockage des rsultats Tri et recueil des cellules en tubes ou plaques de microtitration *La diffusion aux grands angles (90) de la lumire traversant la cellule donne des informations sur cours E. Grelier la forme, la structure et le volume de la cellule et de son noyau tandis que la diffusion aux petits angles de la lumire diffracte par des petites particules donne des renseignements sur la granularit 10 Un exemple danalyse avec un cytomtre de flux : lanalyse des cellules sanguines Voir vido sur lintrt dans ltude de lvolution de linfection par le VIH :

( partir de 13 min 47) http://www.canal-u.tv/video/science_en_cours/la_cytometrie_en_flux.36 cours E. Grelier 11 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification: chromatographie daffinit Connaissance dune molcule de surface spcifique du type cellulaire trier

Lectines : protines dorigine vgtale se fixant avec une grande affinit des groupements glucidiques spcifiques rencontrs au niveau des glycoprotines prsentes la surface des cellules Anticorps spcifiques des cellules dintrt agitation modre changement de pH changement de force ionique pour casser les liaisons faibles formes entre ligands. Couplage de cette molcule diverses matrices (billes de plastique ou de latex) places dans une colonne Dpt de la suspension cellulaire trier sur la colonne ainsi forme Fixation des cellules dintrt Rcupration par

Technique spcifique, relativement peu onreuse (rgnration de la colonne) ncessitant un compromis efficace pour luer toutes les cellules retenues pour avoir un bon rendement sans pour autant les altrer. cours E. Grelier 12 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification: chromatographie daffinit http://espacesciences.com/Techniques/sepmol/Chromato/ ndev/coursepmol.htm cours E. Grelier

13 I. Techniques de sparation et de purification cellulaire 2. Purification: Tri immunomagntique Tri immunomagntique Principe de cette technique trs semblable celui de la chromatographie daffinit Incubatio Connaissance dune molcule de surface n spcifique du type cellulaire trier Utilisation contre cette molcule dun anticorps

coupl une bille mtallique base de fer. Incubation de la suspension cellulaire avec cet anticorps Retenue Dpt de cette suspension sur une colonne place dans un champ magntique cre par un aimant. Retenue des cellules marques Rcupration de ces cellules aprs retrait de laimant Technique trs spcifique, rapide dun bon rendement. assez onreuse (colonnes usage unique). cours E. Grelier

lutio n 14 II. Mthodes dtude de la morphologie des cellules : techniques dexamens microscopiques 1. Grossissement et rsolution cours E. Grelier 15 1 cm il nu 1 mm 100m

10 m 1 m 100 nm 10 nm 1nm Atome Molcule Macromolcule Virus/ribosome Bactrie

Cellule vgtale Cellule animale Ncessit du grossissement 0,1 nm Microscope photonique Microscope lectronique cours E. Grelier 16 II - Techniques dexamen microscopique 1. Grossissement et rsolution Grossissement du microscope = Grossissement de lobjectif x Grossissement de loculaire Limite du grossissement : le pouvoir de rsolution de lil sur celui du

microscope : En microscopie photonique, avec les pouvoirs de rsolution de linstrument et de lil, le grossissement limite est de 1000 En microscopie lectronique transmission, le grossissement maximal que de 1 000 000 cours E. Grelier 17 II - Techniques dexamen microscopique 1. Grossissement et rsolution Le pouvoir de rsolution est une proprit instrumentale, une valeur absolue et thorique la meilleure rsolution atteignable pour un instrument

particulier et dans des conditions dobservation optimum La rsolution est une valeur dpendant des conditions exprimentales dobservation gale ou infrieure au pouvoir de rsolution la possibilit de distinguer des points rapprochs dobjets distincts La limite de rsolution est la plus petite distance sparant deux points reconnus comme objets distincts 75 m pour lil nu 0,25 m pour les meilleurs microscopes photoniques 0,002 m pour les microscopes lectroniques transmission cours E. Grelier 18 II - Techniques dexamen microscopique 1. Grossissement et rsolution: exercices Calcul de d : limite de rsolution d = 1/PR = c / n sin = longueur donde du faisceau lumineux n = indice de rfraction du milieu

= angle de demi ouverture de lobjectif c = constante = 0,61 Dductions thoriques Diminution de diminue, d et augmentation n augmente, de PR si a augmente Applications pratiques Microscope pifluorescence avec UV Utilisation de lhuile immersion Ouverture augmente la construction cours E. Grelier 19

II - Techniques dexamen microscopique 1. Grossissement et rsolution: exercices Indiquer si des objets distants de 3 m, 300 nm, 3000 peuvent tre discerns pour le matriel utilis suivant : un bon microscope photonique quip dun oculaire x10 et dun objectif immersion x 100 et dune limite de rsolution de 2,5 m . Calculer d dans le cas o un filtre violet est dispos sur la source lumineuse ( = 400 nm) sachant que d = 1 m en lumire jaune ( = 570 nm) o la mise au point est faite sec sans huile immersion. Donnes nhuile = 1,6 d1 = c 1/nnh . sin et d2 = c 2/nn . sin do d2 = d1 2/n 1 = 400/n570 = 0,7 d1 = c 1/nnh . sin et d2 = c 1/nne . sin do d2 = nh x d1 /n ne = 1,6 cours E. Grelier 20

II. Mthodes dtude de la morphologie des cellules : techniques dexamens microscopiques 2. Prparations pour lobservation microscopique cours E. Grelier 21 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique Schmas de principe des microscopes Photonique lectroniques transmission (MET) Source dlectrons : filament chauff soumis une forte ddp Source de

photons : lampe >100 kVolts Condenseur Lame support objet transparent Objectif balayage (MEB) 1 40 kvolts Condenseur Grille de cuivre support objet transparent Objectif(s) rglables Bobines dflectrices

donnant un faisceau mobile dlectrons balayant lobjet Image vido Vide Oculaire Projectif Oeil Dtecteur cran fluorescent Plaque photographique Objet non transparent

cours E. Grelier 22 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire Lobservation par transmission exige que les rayons lumineux traversent lobjet. Ainsi lobjet doit tre de faible paisseur cours E. Grelier 23 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire

Lobjet doit tre de faible paisseur Il faut donc raliser une coupe : microtomie Pour cela, il faut durcir lchantillon : inclusion Pour cela, il faut fixer les structures car le durcissement peut les altrer cours E. Grelier 24 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire On rcapitule : Fixation pour consolider Inclusion pour durcir lchantillon

Microtomie pour couper Coloration pour le contraste cours E. Grelier 25 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire Etape 1: la fixation Elle peut tre chimique: avec des fixateurs coagulants (pour les tissus) ou non coagulants (cytologie). Elle peut tre physique: la conglation (qui doit tre rapide): cest la meilleure technique.

cours E. Grelier 26 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire Etape 2: linclusion l'eau des cellules est remplace par de la paraffine chaude qui durcit en refroidissant. NB: Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible: ces deux liquides n'tant pas miscibles. On doit en premier lieu substituer l'eau des cellules fixes de l'thanol, puis du tolune qui peut se mlanger la paraffine liquide chaude. On peut aussi durcir avec la conglation. cours E. Grelier 27 II - Techniques dexamen microscopique

2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire Etape 3: la coupe On utilise un microtome : rasoir dacier Aprs inclusion la paraffine : coupes de 2 5 m,m, Aprs conglation : coupes de 5-10 m,m. NB : Lorsqu'on travaille avec des chantillons congels, le microtome est quip d'une enceinte maintenue 20C. http://www.youtube.com/watch? v=1lY1CDKfj1M cours E. Grelier 28 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 1. en cas de microscopie lumire La coloration Colorants vitaux Colorants non vitaux

Ils ne tuent pas les cellules mais sont peu nombreux Ex: rouge neutre Ils tuent la cellule et ncessitent une fixation de la cellule au pralable. Observation de cellules doignons au microscope photonique cours E. Grelier 29 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique a/ Prparation 1/ Lobservation se fait sous-vide, il faut donc dshydrater lchantillon pour viter le bouillonnement. .

Vido cours E. Grelier 30 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique On rcapitule : Fixation pour consolider Dshydratation Inclusion pour durcir lchantillon Vido Ultra microtomie pour couper Obtention de contraste

cours E. Grelier 31 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique b/ Contraintes spcifiques au MET Le support de lchantillon doit tre permable aux lectrons : membrane de carbone ou d'un polyvinyle comme le formvar). Ce support est lui-mme soutenu par une grille de cuivre de 3 mm de diamtre maille fine (maille de 100 300 m de ct)m de ct) cours E. Grelier 32 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique b/ Contraintes spcifiques au MET

Lobservation des spcimens par transmission ne donne des renseignements que si certaines rgions diffusent plus les lectrons que d'autres et prsentent donc des contrastes. Les lments avec un numro atomique faible laissent passer les lectrons contrairement aux lments avec un numro atomique fort (or/ tungstne) cours E. Grelier 33 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique b/ Contraintes spcifiques au MET: Obtention de contrastes. - Technique de l'ombrage = vaporisation sous vide des mtaux avec une direction faisant un angle faible avec le plan de la prparation (= sous incidence rasante). Les vapeurs mtalliques viennent se dposer sur la membrane-support et la surface des objets, mais chaque objet forme un obstacle au dpt mtallique. On obtient ainsi un effet d'ombre sur la membrane support. .

Fibriline en forme dtoiles regroupes en chane. Cest un constituant du cartilage Filament dadn droul http://temsamprep.in2p3.fr/fiche/fiche.php? 34 lang=fr&fiche=32 cours E. Grelier II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique b/ Contraintes spcifiques au MET: Obtention de contrastes. Pillis autour dune bactrie dont on distingue une partie en bas. http://temsamprep.in2p3.fr/fiche/fiche.php? 35 lang=fr&fiche=32

cours E. Grelier II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique b/ Contraintes spcifiques au MET: Obtention de contrastes. - Technique de coloration ngative : on place les objets dans une solution aqueuse d'acide phosphotungstique et on dpose une gouttelette de cette suspension sur une grille recouverte d'une membrane-support. En schant lacide phosphotungstique forme entre les structures un cran que les lectrons ne peuvent traverser. Les lectrons traversent les structures que lon veut observer : image en ngatif. Particules de rotavirus en microscope lectronique en coloration ngative (x 198000)

(Clich : collection du Pr. M. Castets, service de microscopie lectronique (Pr. Ph. Rabin) CHU de Poitiers, France) cours E. Grelier 36 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique b/ Contraintes spcifiques au MET: Obtention de contrastes. Les bains dans les sels de mtaux lourds. - - - - Ac marqus cours E. Grelier

37 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique c/ Contraintes spcifiques au MEB. Les chantillons biologiques dshydrats sont isolants donc il faut rendre leur surface conductrice: vaporisation sous vide dune mince couche dor ou de platine dans le cas du MEB cours E. Grelier 38 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique d/ Observation de coupes paisses. Pour mieux comprendre la disposition

des structures dans l'espace : Coupes paisses. L'utilisation de microscopes lectroniques haute tension (1 3 millions de volts) cours E. Grelier 39 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique 2. En cas de microscopie lectronique e. La cryofracture - sandwich d'chantillon d'une paisseur de l'ordre de 20 micromtres. -Vitrification de lchantillon 200C -Sparation des deux plaquettes de cuivre

cours E. Grelier 40 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique La cryofracture -L'chantillon est alors fractur. La ligne de fracture passe par les zones de moindre rsistance, sparant l'chantillon en deux parties. -Projection du mlange platine-carbone 45 sur la surface fracture de l'chantillon. Ce procd permet d'obtenir une rplique de la surface. - cours E. Grelier 41 II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique La cryofracture

Le carbone est travers par les lectrons Le platine les arrte de faon plus ou moins totale selon l'paisseur rencontre par le faisceau. Zones riches en platine qui apparaissent en noir sur le film photographique zones sans relief: grises et zones sans platine: blanches. Dans bien des cas, elle permet d'obtenir de prcieuses informations sur la structure de l'chantillon. - cours E. Grelier 42

II - Techniques dexamen microscopique 2. Prparation pour lobservation microscopique La cryofracture - cours E. Grelier 43 une image obtenue par cryodcapage montrant l'organisation membranaire de la cellule ( gauche, le noyau, droite des nappes de rticulum endoplasmique). cours E. Grelier 44

II. Mthodes dtude de la morphologie des cellules : techniques dexamens microscopiques 3. Microscopie photonique cours E. Grelier 45 II - Techniques dexamen microscopique 3. Microscopie photonique Rappel: Schmas de principe du microscope photonique Source de photons : lampe Condenseur Lame support objet transparent Les chantillons biologiques observs

sont traverss par la lumire. Objectif Oculaire Oeil cours E. Grelier 46 3. Microscopie photonique Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope contraste de phase Utilisation des diffrents indices de rfraction des milieux traverss par la lumire pour contraster les structures cellulaires

sans coloration. cours E. Grelier Intrt: possibilit dobserver des cellules vivantes et leur mouvement en microcinmatographie acclre 47 3. Microscopie photonique Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope pifluorescence Utilisation des marqueurs (fluorochromes : fluorescine, rhodamine) capables -dabsorber un rayonnement de faible longueur donde et de forte nergie mis par une

source dUV et - dmettre (par excitation) un rayonnement de grande longueur donde mais de faible nergie dans le visible -NB: chlorophylle par exemple ne ncessite pas lutilisation de fluorochrome. Observation de lADN avec un microscope pifluorescence aprs utilisation de fluorochrome http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Microscopie/fluo/fluo.htm cours E. Grelier 48

3. Microscopie photonique Types particuliers de microscopies photoniques: le microscope pifluorescence Rappelez-vous : quel est limpact de lutilisation dUV plutt que de la lumire blanche sur la limite de rsolution ? Dductions thoriques Diminution de diminue, d et augmentation n augmente, de PR si a augmente Applications pratiques Microscope pifluorescence avec UV Utilisation de lhuile immersion Ouverture augmente la construction cours E. Grelier

49 3. Microscopie photonique Types particuliers de microscopies photoniques : le microscope pifluorescence Un microscope pifluorescence amlior : le microscope confocal Exploitation du principe de la fluorescence mise par plusieurs composs excits par un rayonnement cohrent (LASER) qui balaye lobjet en largeur et en profondeur : la dtection de limage slectionne par un filtre prcis (liminant les missions parasites) permet une reconstitution par ordinateur dimages ventuellement en trois dimensions cours E. Grelier 50 II. Mthodes dtude de la morphologie des cellules : Techniques dexamens microscopiques

4. Microscopie lectronique cours E. Grelier 51 4. Microscopie lectronique Principe Ce nest plus de la lumire qui est utilise mais un flux dlectrons. Les lectrons en mouvement crent une onde de longueur d'onde plus courte que celle de la lumire. La limite de rsolution d'un microscope lectronique sera donc plus petite et le pouvoir sparateur plus lev que celui d'un microscope photonique. cours E. Grelier 52

4. Microscopie lectronique * Inconvnients : 1/ Les ne se propagent que dans le vide trs pouss ce qui empche toute observation sur le vivant ; 2/ La pntration des dans la matire est trs faible, donc les coupes doivent tre trs minces (de l'ordre de 0,06 0,09 m,m ~ 0,1 m,m pour 2 5m,m en microscopie photonique) ; on utilisera un ultramicrotome. cours E. Grelier 53 4. Microscopie lectronique Schmas de principe des microscopes lectroniques transmission (MET) balayage (MEB) Source dlectrons : filament chauff soumis une forte ddp >100

kVolts 1 40 kvolts Condenseur Grille de cuivre support objet transparent Objectif(s) rglables Bobines dflectrices donnant un faisceau mobile dlectrons balayant lobjet Vide Projectif Image vido Dtecteur

Objet non transparent cran fluorescent Plaque photographique cours E. Grelier 54 4. Microscopie lectronique : Le MET Ce sont les qui traversent l'chantillon qui contribuent directement la formation de l'image. On ne peut qu'observer des objets trs minces, gnralement on s'adresse des coupes. Observation dun chloroplaste au MET Vido cours E. Grelier

55 4. Microscopie lectronique: Le MEB Les chantillons sont bombards par un faisceau d', mais seuls sont utiliss pour la formation de l'image, les qui sont rmis par la surface de l'chantillon. A la diffrence du microscope lectronique par transmission, il est donc possible d'tudier des chantillons massifs dont seule la surface est observe. Observation dun grain de pollen au MEB Vido MEB cours E. Grelier 56 III. Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire

cours E. Grelier 57 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Etape 1 : clatement de la cellule Pour rcuprer des organites Pour tudier les organites Etape 2 : sparation des organites cours E. Grelier 58

III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire clatement de la cellule Techniques physiques : ultrasons ou hautes pressions chimiques : choc osmotique, action de dtergents ou denzymes mcaniques : pistons et cylindres comme tube de Potter cours E. Grelier 59 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire

Lhomognat est conserv 0C Pourquoi? . Prservation maximale des structures et fonctions des diffrents constituants cellulaires et des enzymes cours E. Grelier 60 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Quel est le contenu de lhomognat ? noyaux, mitochondries, lysosomes et peroxysomes fragments provenant des ruptures membranaires (plasmique, rticulum, Golgi) se refermant immdiatement pour donner de petites vsicules

fermes appeles microsomes cours E. Grelier 61 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Etape 1 : clatement de la cellule Pour rcuprer des organites Pour tudier les organites Etape 2 : sparation des organites cours E. Grelier

62 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Sparation des organites par ultracentrifugation diffrentielle srie de centrifugations de plus en plus longues et donnant des champs de gravit de plus en plus levs pour fractionner lextrait initial en une srie de culots et surnageants. technique prparative rapide, simple et permettant de manipuler des grandes quantits de matriel sans donner cependant de fractions parfaitement pures. cours E. Grelier 63

III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Sparation des organites par ultracentrifugation diffrentielle Cellules vivantes Broyage Homognat Surnageant Surnageant Centrifugation 1000 g 10 min Centrifugation 20000 g 20 min Centrifugation 80 000 g 60

min Culot : Noyaux et dbris Culot : mitochondries, lysosomes et peroxysomes Culot : microsomes (membranes fragmentes) cours E. Grelier 64 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Sparation des organites par ultracentrifugation sur gradient de densit gradient prform

gradient autoform cours E. Grelier 65 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Sparation des organites par centrifugation sur gradient de densit prform Protocole Dpt dune fine couche de lhomognat la surface du gradient contenu dans le tube centrifuger : solution de saccharose ou de glycrol dont la concentration varie de faon

rgulire et dcroissante du bas vers le haut du tube, variation linaire et continue ou bien discontinue et par paliers. Centrifugation vitesse leve pendant quelques heures. Migration des particules dans le gradient jusqu une position dquilibre qui correspond sa densit Obtention danneaux le long du tube (centrifugation zonale) qui peuvent tre rcuprs sparment par aspiration. Technique permettant dobtenir une sparation des constituants cellulaires en une seule tape dun grand degr de puret. ne permettant de manipuler que de petits volumes de matriel biologique et constituant donc une technique uniquement analytique.

cours E. Grelier Lysosomes (1,12 g/mL) Mitochondries (1,18 g/mL) Peroxysomes (1,23 g/mL) 66 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Sparation des organites par centrifugation sur gradient de densit autoform galement appele centrifugation sur gradient de densit lquilibre.

Dilution de lhomognat dans une solution concentre de chlorure de csium (CsCl) Centrifugation de cette prparation plus de 200 000g pendant plusieurs heures. Sdimentation des ions Cs+ trs denses tablissement dun gradient de concentration (gradient de densit) Rpartition des constituants de lhomognat dans ce gradient selon leur densit Obtention danneaux le long du tube Rcupration des diffrentes fractions. Cette technique permet de sparer les molcules indpendamment de leur taille et avec des diffrences de densit trs faibles (elle permet notamment de sparer des fragments dADN ayant du N 14 de ceux ayant du N15). Technique mise au point par Svedberg (1923) pour dterminer des masse molculaires et applique la biologie par le physiologiste belge Albert Claude (Prix Nobel 1974) pour isoler les microsomes Dtermination de Coefficient de Sdimentation exprim en units Svedberg S dfini comme la vitesse de sdimentation (m/s) par unit dacclration (m/s2) et quivalent 10-13s

cours E. Grelier 67 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 1. Techniques de fractionnement cellulaire Sparation des organites par centrifugation sur gradient de densit autoform 3- Densit croissante cours E. Grelier 68 III. Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage

cours E. Grelier 69 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage Elastine dans le derme (Coloration de WEIGERT grossissement x 400) http://bioimage.free.fr/his_image/elastique_1_10.htm cours E. Grelier 70 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage

Rticuline dans les tubules rnaux (coloration Gordon Sweets x 250) http://bioimage.free.fr/his_image/fibres_de_reticuline.htm cours E. Grelier 71 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage Mucus : coupe de la muqueuse oesophagienne (coloration PAS x 100). http://bioimage.free.fr/his_image/pas_glandes_muqueuses_oesophage_5.htm

cours E. Grelier 72 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage bronche tertiaire avec son pithlium cylindrique cili et cellules caliciformes entour de tissu conjonctif et de fibres musculaires lisses Coloration Hmalun Phloxine Safran Grossissement x 200 http://bioimage.free.fr/his_image/bronches_200.htm cours E. Grelier 73

III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules 2. Marquage frottis de sang d'anmie sidroblastique montrant un sidroblaste II (rythroblaste acidophile possdant dans son cytoplasme des grains d'hmosidrine (molcule de stockage du fer) car il ne peut intgrer le fer dans l'hmoglobine la coloration est la coloration de Perls x 1000 http://bioimage.free.fr/hem_image/sidero8g.htm cours E. Grelier 74 III Mthodes dtude de la composition

biochimique des cellules 2. Marquage frottis de leucmie aigue o les blastes (cellules cancreuses) possdent dans leurs granulations de la myloperoxydase mise en vidence par ajout d'un substrat qui prcipite sous forme de grains bleus ce qui fait classer le leucmie en LAM (leucmie aigu myloblastique). http://bioimage.free.fr/hem_image/peroxps7g.htm cours E. Grelier 75 III Mthodes dtude de la composition biochimique des cellules

2. Marquage Marquage spcifique par des conjugus (marqueurs fixs sur des anticorps) Fluorochrom es Isotopes radioactifs Enzymes (peroxydase ou phosphatase alcaline) Fuseau mitotique mis en vidence par un anticorps antitubuline reconnu par un anticorps maqu lAlexa 488 Chromosome rvl en bleu par du DAPI (colorant spcifique des bases nuclotidiques) Or (ou argent) collodal Ferritine (cur de fer opaque aux lectrons) Granules scrtoires de

cellules gastriques mis en vidence par un anticorps antigastrine reconnu par un conjugu (anti Ig coupl la ferritine) MET cours E. Grelier Glucagon mis en vidence dans des cellules pancratiques par un anticorps antiglucagon reconnu par un conjugu (anti Ig coupl lor collodal) MET 76 IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 1. Isotopes radioactifs cours E. Grelier

77 IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 1. Isotopes les plus utiliss Notion disotopes lments chimiques ayant le mme nombre dlectrons que les lments naturels mais diffrant par la masse de leur noyau. pouvant tre instables : radioactifs car subissant des dsintgrations librant des lectrons ou des radiations dtectes : par un compteur Geiger (mesure de lionisation produite par les radiations dans un gaz) par un compteur scintillation (mesure dclairs lumineux provoqus dans un liquide scintillant) par son action sur le bromure dargent dune mulsion photographique que les radiations rduisent en argent mtallique et qui est ensuite dveloppe sous forme de taches visibles.

principaux radio-isotopes utiliss en biologie H (acides mins, oses, nuclotides) C (acides amins, nuclotides) 32 P (nuclotides) 35 S (acides amins soufrs) 22 Na 42 K 125 I. 3

14 cours E. Grelier 78 IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 2. Principe cours E. Grelier 79 IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 2. Principe Pulse chase permettant dtudier le mtabolisme cellulaire Pulse : mises en prsence pendant une courte dure de cellules vivantes et dun prcurseur mtabolique radioactif dit chaud qui est

incorpor dans la cellule entrant dans certaines ractions mtaboliques. Chase : maintien des cellules dans un milieu contenant un large excs de prcurseur froid et donc limination progressive du prcurseur chaud jusqu ce que seule une petite quantit soit incorpor dans la cellule. Dtection : prlvements espacs rgulirement permettant de suivre les transformations du prcurseur chaud en diverses molcules portant le marquage radioactif ou ralisation dautoradiographies afin de localiser dans quel compartiment se 80 cours E. Grelier situent les molcules radioactives. IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 3. Dtection de la radioactivit des prparations biologiques :

lautoradiographie cours E. Grelier 81 IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 3. Lautoradiographie Marquage radioactif Autoradiographie permettant la localisation de composs radioactifs dans des cellules entires ou des coupes de tissus. Coupe de cellule Noyau mulsion photographique

Exposition de cellules vivantes un pulse rapide dun compos radioactif. Lavage, fixation puis traitement pour lobservation en microscopie photonique ou lectronique. Dpt sur la prparation dune mince couche dmulsion

photographique et incubation. Dveloppement de lmulsion Localisation de la radioactivit par la position des grains dargent cours E. Grelier Atome radioactif Grain dargent Trajet des lectrons Grain dargent 82 IV. Mthode dtude du mtabolisme cellulaire 3. Lautoradiographie Autoradiographie en microscopie lectronique d'une cellule pithliale provenant dun animal auquel de la

thymidine tritie a t administre quatre jours auparavant. Lincorporation de thymidine tritie dans le noyau, rsulte dune synthse dADN utilisant cette base nuclotidique. Elle signe lapparition dune cellule nouvellement forme. cours E. Grelier 83 V. Culture cellulaire 1. Conditions respecter cours E. Grelier 84 V. Culture cellulaire 1. Conditions respecter

Temprature rgule la plus proche possible de la temprature naturelle. pH neutre maintenu grce lemploi de solutions salines tamponnes et une atmosphre enrichie en CO2. Prsence de nombreux lments nutritifs : glucose, sels minraux, acides amins. Prsence de facteurs de croissance : vitamines et utilisation de srum de veau. Respect dune asepsie stricte : ajout ventuel dantibiotiques aux milieux de culture. Support adapt en verre ou en plastique parfois recouvert de composants de la matrice extracellulaire comme le collagne. cours E. Grelier 85 V. Culture cellulaire

2. Intrts des cultures cellulaires cours E. Grelier 86 V. Culture cellulaire 2. Intrts des cultures cellulaires tude de linfluence de diffrents facteurs sur les cellules : substrats, temprature, substances chimiques, mdicaments Suivi de prcurseurs du mtabolisme marqus pour tudier leur devenir dans la cellule. cours E. Grelier 87 V. Culture cellulaire

3. Diffrents types cellulaires utiliss cours E. Grelier 88 V. Culture cellulaire 3. Diffrents types cellulaires utiliss Cellules issues de tissus normaux Obtention des cellules partir dorganes ou de tissus dorganismes adultes ou embryonnaires par action chimique et mcanique sur le tissu dorigine. mise en cultures dans des botes contenant un milieu de culture adapt dune suspension cellulaire ajustes multiplication pour former un tapis continu (confluence)

arrt des divisions par inhibition de contact. Culture primaire : Passage donnant une culture secondaire : trypsination : dtachement des cellules de la culture primaire du support par action de la trypsine ensemencement des cellules dans un milieu nutritif neuf. 2 ou 3 pour les cellules pithliales, Un peu plus pour les fibroblastes (cellules du tissus conjonctif). Nombre de passage : limit sauf pour les cellules embryonnaires Cellules gardant les caractristiques des cellules du tissu dorigine

cours E. Grelier 89 V. Culture cellulaire 3. Diffrents types cellulaires utiliss Cellules de lignes continues proprits : croissance rapide, perte de linhibition de contact, possibilit dun nombre illimit de passage. obtention : slection de cellules issues de tissus normaux ayant dvelopp une mutation spontane les rendant immortelles comme les cellules 3T3 de rongeur. traitement de cellules normales par des agents chimiques ou physiques mutagnes ou par des virus oncognes pour les rendre immortelles . utilisation

de cellules cancreuses dites transformes (capables dinduire une tumeur aprs injection un animal sain) comme les cellules HeLa (humaines, carcinome de lutrus, utilises depuis 1952) ou de cellules embryonnaires comme les cellules MRC5 90 cours E.embryonnaires Grelier (fibroblastes pulmonaires humains) V. Culture cellulaire 3. Diffrents types cellulaires utiliss Cellules hybrides obtenues par fusion chimique ou physique et possdant, dans un premier temps, deux noyaux spars appeles htrocaryons . donnant aprs mitose des cellules hybrides dans laquelle tous les chromosomes se rassemblent pour former un unique noyau. Technique de culture des hybridomes utilise ds 1976 pour dvelopper la production industrielle

danticorps monoclonaux aprs formation dun htrocaryon entre Un plasmocyte (LB diffrenci) scrteur danticorps spcifiques une cellule de mylome (cancer du tissu conjonctif o les cellules cancreuses sont de nature plasmocytaire) cours E. Grelier 91

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